一、目的要求
1聽．学习并掌握用富尔根氏染色法进行体内观察微生物拟核的原理和方法．
2聽初步了解和掌握提取细菌染色体DNA聽及其体外观察的方法．
二、墓本原理
富尔根氏（Feulgen）染色法是根据席夫氏（Schiff）聽的试剂进行的反应而建立的微生物拟核染色法。席夫氏试剂含有碱性复红和亚硫酸，碱性复红与亚硫酸结合后，失去醒式结构而变为无色，当DNA聽经酸作用而生成的醛化合物与席夫氏试荆结合后，使醒式结构恢复，合成一种带紫红色
的碱性复红衍生物．此染色法对DNA具有特异性，微生物细胞用此法染色后，可在普通光学显微镜下原位观察到细胞内拟核的形态和位置。
富尔根氏染色法主要分两步：（a）将细胞用1聽moL聽HCL温和水解．使DNA中的嗦吟碱与戊箱分开，放出戊糖的醛基；(聽b聽）放出的戊搪醛基与席夫氏试荆作用后呈紫红色．
如果将微生物细胞裂解．使其拟核（即染色体DNA聽）被抽提出来，通过溴化乙锭染色并进行琼脂特凝胶电泳，便可观察到释放到细胞外的染色体DNA聽.聽EB聽是一种扁平分子染料，可特异性括人DNA聽碱基对之间，在紫外线照射下，使DNA聽呈现荧光，因而可观察到凝胶中的染色体DNA聽，由干在提取过程中大分子染色休DNA聽的随机断裂，所以经凝胶电泳后形成的是一条不整齐的浓的荧光带（图IV聽一6聽)聽.聽
用EB聽染色法进行的体外观察染色体DNA也分
两步进行：〔聽a聽）将细胞裂解后抽提染色体DNA聽;聽(聽b聽）通过含有EB聽的琼脂精凝胶电泳在紫外光下观察染色体DNA荧光棒．
三、器材
1聽．菌种聽酿酒酵母，大肠杆菌．
2聽溶液或试剂1mol/L聽HCL2聽％徽酸，Schandiun固定液，亚硫酸水溶液、席夫氏试剂，TE缓冲液，10聽%聽SDS，蛋白酶K聽(聽20聽mg聽/ml聽)聽,聽5聽mol/L聽NaCL，CTAB/NACL,酚／氯仿／异戊醇（25聽:聽24聽:聽1聽)聽,聽异丙醇，70聽％乙醇，溴酚蓝加样缓冲液，TAE聽电泳缓冲液．
3聽仪器或其他用具台式高速离心机，5聽ml塑料离心管，真空干澡器，俄酸燕气瓶等．
四、操作步骤
l聽富尔根氏染色法
(聽l聽）取培养8聽一10h聽的酿酒酵母涂片，室温下风干
(聽2聽〕聽将涂片置于盛有2聽％锇酸的蒸气瓶口上，用俄酸蒸气固定5min聽，然后放入加热至60℃聽的Schandiun固定液中10min聽。
(聽3聽）用水冲洗固定后的标本．然后放在60聽℃聽1mol/L聽HCL中水解8min，水洗．
(聽4聽）用席夫氏试荆作用30~40聽min聽,聽
(聽5聽）由席夫氏试荆中取出放在亚硫酸水溶液中洗5min聽.聽
(聽6聽）由亚硫酸水溶液中取出水洗，干燥后，用油镜观察．
2聽DNA的抽提和溴化乙锭染色
(聽l聽）取4.5ml大肠杆菌过夜培养液干5ml塑料离心管中，12聽000聽r/min聽离心1~2聽min聽，弃上清．
(聽2聽）将细胞沉淀悬浮于1聽.聽7聽mlTE聽缓冲液中．加入10聽%SDS90ul和20mg/ml的蛋白酶K聽9聽ul聽，混匀，37度保温lh聽.聽
(聽3聽）加入5mol/L聽NaCI聽300聽ul聽，充分混匀，再加入240ulCTAB/NACL，混匀，置65℃聽水浴10聽min聽。
（4）加入等体积的酚／氯仿/异戊醇〔聽25聽：24：l聽）混匀，12聽O00r聽／min聽离心5min
（5）将上清水相转人另一洁净的塑料离心管中，加0聽.聽6聽倍体积的异丙醇使DNA聽沉淀下来．
（6）快速离心数秒钟，弃上清，用沁外的乙醇淋洗DNA2次，将DNA沉淀经真空干燥后溶于300聽ul聽TE缓冲液中．
用此法获得的染色体DNA聽可用于限制性酶切等分子生物学操作．
(聽7聽）取少量聽（约3聽~5ul）提取的DNA样品（其余置于一20聽℃聽保存），加入3聽ul溴酚蓝加样缓冲液，混匀后上样进行琼脂糖凝胶电泳1~2聽h聽.聽
琼脂锗中加有EB聽．在电泳过程中，EB聽将插人DNA聽分子中，
(聽8聽）戴上一次性塑料手套（EB聽是强诱变剂）将凝胶取出置于紫外分析仪上观察染色体DNA聽荧光带．聽
五，实验报告
1聽．结果
(聽l聽）根据自己的实验结果，绘图表示细胞内核的形态和位置．
(聽2聽）绘图表示你所观察到的琼脂糖接胶中的染色体DNA聽带。
2聽思考题
(聽l聽）大肠杆菌细胞内的染色体是环形的还是线形的？你从凝胶上观察到的体外染色体DNA聽应是环形的还是线形的？为什么？
(聽2聽）凝胶上显现的染色体DNA带为什么是不整齐的？
聽聽聽
聽聽聽

聽

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