【摘要】聽聽目的聽比较无血清培养基（AIMV）与完全培养基（CM）体外诱导扩增CIK细胞及CIK细胞分泌细胞因子水平。方法聽分别用AIMV及完全培养基加入4种细胞因子(IFNγ、IL2、IL1及OKT3)将脐带血单个核细胞(CBMNCs)诱导成CIK细胞，比较细胞的增殖能力、细胞表型及分泌细胞因子水平。结果聽与完全培养基比较，无血清培养基培养的CIK细胞增殖高峰较晚(14～17天),但增殖倍数高，在细胞表型、分泌细胞因子水平方面两种培养基培养的CIK细胞均无明显的差别（P＞0.05）。结论聽无血清培养基可代替完全培养基。聽
【关键词】聽聽无血清培养基聽免疫聽细胞培养聽细胞因子聽肿瘤
聽聽聽0聽聽引言
聽聽聽聽CIK细胞（Cytokineinduced聽killer，CIK）是将人外周血单个核细胞，在体外用多种细胞因子（如IFNγ、IL2、IL1及OKT3等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。具有极强的增殖能力及杀伤肿瘤细胞的能力。Critzapis等[1]报道，CIK细胞分泌多种细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用从而杀伤肿瘤细胞。治疗所需的CIK细胞在体外培养时所用的条件对细胞的活性有很大影响。现在常用于细胞培养的完全培养基,因含有人AB血清,虽经HBV、HCV及HIV的检测,但仍有可能传播其他疾病,安全性低;并且存在批次差异、不宜质控，质量不能保证。无血清培养基则可达到生物洁净要求,成分明确,质量稳定,便于质控,克服了人ＡＢ血清的缺点,能减少病人意外感染的机会，对于免疫治疗的推广应用有重要意义。为此,我们比较了无血清培养基（ＡＩＭＶ）与完全培养基(含10%胎牛血清RPMI聽1640)培养CIK细胞分泌细胞因子水平。
聽聽聽聽1聽聽材料与方法
聽聽聽聽1.1聽聽材料聽
聽聽聽聽健康足月产胎儿脐带静脉血50ml(枸橼酸钠抗凝),产妇各项生化指标检测正常。RPMI1640培养基、淋巴细胞分离液和无血清培养基购自GIBCO公司,细胞因子购自Bioscience公司,聽流式试剂CD45FITC/CD4PE/CD8ECD/CD3PC5、CD3FITC聽CD16+CD56PE和PI染液购自BeckmanColuter公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司。
聽聽聽聽1.2聽聽方法
聽聽聽聽1.2.1聽聽细胞培养
聽聽聽聽脐血用淋巴细胞分离液作密度梯度2500r/min离心30min分离的外周血单个核细胞,聽分别用完全培养基(RPMI聽1640,含10%胎牛血清,100μｇ/ｍｌ链霉素,100Ｕ/ｍｌ青霉素)和无血清培养基调整细胞数为1×106个/ml,接种于24孔培养板,930μl/孔。第1天加入rhIFNγ聽1聽000u/ml,培养24h后加入rhIL2聽300u/ml、rhIL1聽100u/ml及OKT聽350ng/ml继续培养,每隔4d更换培养基,调细胞数为1×106个/ml,补加rhIL2聽300u/ml,每8d在补加rhIL2的同时补加OKT聽350ng/ml。YTMLC、GLC和A549用含10%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI聽1640常规培养。设不加细胞因子的CBMNCs培养作为对照。
聽聽聽聽1.2.2聽聽细胞表型分析
聽聽聽聽于培养的第0、4、8、10、12、14、17、21d对以上各组效应细胞进行分析,每组每次测4个复孔。
聽聽聽聽1.2.3聽聽细胞增殖能力测定
聽聽聽聽于培养的第0、4、8、10、12、14、17、21d分别取细胞用台盼蓝拒染法计数所培养的活细胞浓度,根据流式检测的CIK的比例，计量液量,推算CIK细胞总数。
聽聽聽聽1.2.4聽聽CIK细胞分泌IL2、IFNγ、TNFα细胞因子水平测定
聽聽聽聽于培养的第0、4、8、10、12、14、17、21d分别取细胞,充分洗涤,调整细胞浓度为2×106/ml培养24ｈ后,收集上清,用ＥＬＩＳＡ法定量测定细胞培养上清中IL2、IFNγ、TNFα，设4个平行孔。
聽聽聽聽2聽聽结果
聽聽聽聽2.1聽聽ＡＩＭＶ与完全培养基培养CIK细胞增殖能力的比较
聽聽聽聽实验表明,ＡＩＭＶ培养细胞较完全培养基培养细胞增殖迟缓。完全培养基增殖高峰期在第12d，增殖平台为第10～12d，最高增殖倍数为638.4倍；而ＡＩＭＶ培养基增殖高峰期在第14d，增殖平台为第14～17d，最高增殖倍数为678.7倍。虽然ＡＩＭＶ培养细胞较完全培养基培养细胞增殖迟缓，但其增殖平台期较长，增殖倍数较完全培养基高，见图1。
聽聽聽聽图1聽聽AIMV与完全培养基培养CIK细胞增殖能力
聽聽聽聽2.2聽聽ＡＩＭＶ与完全培养基培养细胞表型比较
聽聽聽聽实验结果表明，两种培养基培养的细胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+细胞所占百分比逐渐增多，CD3+CD56+细胞在ＡＩＭＶ培养基中，增长高峰在14～17d，所占相对百分率由（0.21±0.04）上升为（31.53±1.65）,增长了150.14倍，完全培养基增长高峰在12～14d，所占相对百分率由（0.21±0.04）上升为（30.90±2.28），增长了147.14倍。对照组CBMNCs培养体系中未出现明显的细胞表型转化,各种细胞成分均呈递减趋势，见表1、图2。
聽聽聽聽2.3聽聽AIMV与完全培养基培养的CIK细胞分泌细胞因子水平
聽聽聽聽2.3.1聽聽IL2水平
聽聽聽聽AIMV与完全培养基培养的CIK细胞均分泌IL12，从第4d分泌量均稳定升高，都于12d达到高峰，第14d略有下降为，以后逐渐下降。但AIMV培养基第12d的IL2水平（222.525±19.889）pg/ml明显高于完全培养基培养组（189.075±6.343）pg/ml，且下降水平也慢于CM组，见图3。
聽聽聽聽A：培养前；B：完全培养基培养后；C：AIMV培养基后表1聽聽ＡＩＭＶ与完全培养基培养细胞不同时间的表型变化
2.3.2聽聽IFNγ水平
聽聽聽聽AIMV与完全培养基培养的CIK细胞均分泌IFNγ，在第4d聽IFNγ水平开始升高，第14～17d分泌量增大，完全培养基培养组第17d达到高峰为（246.854±4.758）聽pg/ml，而AIMV组14d达到高峰（227.88±3.048）pg/ml，高峰期后均迅速下降，见图4。
聽聽聽聽2.3.3聽聽TNFα水平
聽聽聽聽AIMV与完全培养基诱导培养的CIK细胞均分泌TNFα，第4～17dTNFα水平均平稳升高，完全培养基组第17d达到高峰为（247.032±9.117）聽pg/ml，第21d略有下降为（186.953±3.815）pg/ml，而AIMV组14d达到高峰为（222.53±8.965）pg/ml，之后TNFα水平开始下降，见图5。
聽聽聽3聽聽讨论
聽聽聽聽CIK生物免疫治疗已作为肿瘤综合治疗中的一种重要手段，能清除恶性肿瘤患者术后、放化疗后微小残留病灶及调节患者的免疫能力。但现在用于CIK扩增培养的培养基一般为AB血清培养基，但人ＡＢ血清存在安全性低,不宜质控等缺点,无血清培养基正得到越来越广泛的应用。多数研究表明,无血清培养基可代替含血清的完全培养基,二者所得培养物的数目和功能相当[24];但也有不同的观点,认为应用无血清培养基所得细胞功能受到损害[5,6]。无血清培养基ＡＩＭＶ是美国Ｇｉｂｃｏ公司专为体外培养淋巴细胞设计的产品,可用于临床试验。因为人ＡＢ血清存在个体差异、质量不稳定等诸多的不确定因素,因而我们选择美国Ｇｉｂｃｏ公司的胎牛血清配制完全培养基作为标准对照,与无血清培养基ＡＩＭＶ作对比，探讨无血清培养基代替完全培养基的可行性。
聽聽聽聽我们从细胞增殖能力、细胞表型分析及体外CIK细胞分泌的细胞因子等几个方面进行比较。在细胞增殖能力方面，虽然ＡＩＭＶ培养基培养的CIK细胞较完全培养基培养细胞增殖迟缓，完全培养基增殖高峰期在第12天，增殖平台为第10～12天，而ＡＩＭＶ培养基增殖高峰期在第14天，增殖平台为第14～17天，但ＡＩＭＶ培养基培养的CIK细胞增殖平台期较长，增殖倍数（678.7倍）较完全培养基（638.4倍）高。这说明无血清培养基支持细胞增殖能力的更为稳定可靠，也提示使用不同的培养基在回输时间上应有所区别。在两种培养基培养单个核细胞诱导增殖的过程中，各细胞表型虽在培养过程中有一定的差异，但在增殖高峰期无明显差别。
聽聽聽聽CIK细胞具有较强的杀瘤活性，其作用可能与其在增殖过程中能分泌某些细胞因子有关，其主要效应细胞为CD3+CD56+细胞，并出现大量增殖，Lopez等[7]发现CD56+细胞能高表达IFNγ和TNFα，Hoyle等[8]用FACS检测到CIK细胞能表达IL2、IFNγ及TNFα，这与我们的研究结果:CIK在体外诱导培养过程中能分泌IL2、IFNγ、TNFα一致。细胞因子在抗肿瘤的网络调控机制非常复杂，IL2、IFNγ、TNFα在体内外抗肿瘤的过程起着重要的抗肿瘤及调节机体免疫功能的作用。分泌IL2，从第4天分泌量均稳定升高，都于12天达到高峰，以后逐渐下降。但AIMV培养基第12天的IL2水平（222.525±19.889）pg/ml明显高于完全培养基组（189.075±6.343）pg/ml，下降水平也慢于CM组；IFNγ水平在第4天均开始升高，第14聽～17天分泌量增大，完全培养基组第17天达到高峰为（246.854±4.758）聽pg/ml，而AIMV组14天达到高峰（227.88±3.048）pg/ml；而TNFα，第4～17天TNFα水平均平稳升高，完全培养基组第17天达到高峰为（247.032±9.117）聽pg/ml，而AIMV组14天达到高峰为（222.53±8.965）pg/ml。可见，无论是AIMV培养基还是完全培养基其分泌细胞因子的趋势是一致的，只是分泌IFNγ、TNFα水平AIMV培养基（14天）较全培养基（17天）早，但分泌水平无明显差别（P>0.05）。AIMV培养基分泌细胞因子高峰与CIK效应细胞CD3+CD56+细胞增殖高峰一致（14天），因CIK细胞回输时间最好应为在CIK细胞增殖高峰及细胞因子分泌高峰时，这有利于发挥其最佳疗效，从这方面考虑，AIMV培养基优于全培养基。
聽聽聽聽我们的实验表明，无血清培养基成分明确,来源稳定,功能可靠,易于质控，有利于保障患者治疗的安全。可完全替代完全培养基，避免不必要的医疗纠纷，因而在生物治疗中有巨大的优势和广阔的应用前景。
聽
【参考文献】
聽聽［1］聽Critzapis聽A聽D,聽Dimitroulopoulos聽D,聽Paraskevas聽E,聽et聽al.聽Large聽scale聽expansion聽of聽CD3+CD56+聽lymphocytes聽capable聽of聽lying聽autologous聽tumor聽cells聽with聽cytokinerich聽supernatants\[J\].聽Cancer聽Immunol聽Immunother,2002,51(8):440448.

［2］Lefebvre聽P,聽Winter聽J聽N,聽Kahn聽L聽E,聽et聽al.聽Megakaryocyte聽ex聽vivo聽expansion聽potential聽of聽three聽hematopoietic聽sources聽in聽serum聽and聽serumfree聽medium聽\[J\].聽J聽Hematother,1999,8（2）:199208.

［3］Bulter聽M,聽Burgener聽A,聽Patrick聽M,聽et聽al聽.Application聽of聽a聽serumfree聽medium聽for聽the聽growth聽of聽Vero聽cells聽and聽the聽production聽of聽reovirus\[J\].Biotechnol聽Prog,2000,16（5）:854858.

［4］Kambe聽N,聽Kambe聽M,聽Chang聽HW,聽et聽al.聽An聽improved聽proved聽procedure聽for聽the聽development聽of聽human聽mast聽cells聽from聽dispersed聽fetal聽liver聽cells聽in聽serumfree聽culture聽medium聽\[J\].聽J聽Immunol聽Methods,聽2000,240（12）:101110.

［5］Sekhar聽M,聽Yu聽JM,聽Soma聽T,聽et聽al.聽Murine聽longterm聽repopulating聽ability聽is聽compromised聽by聽ex聽vivo聽culture聽in聽serumfree聽medium聽despite聽preservation聽of聽committed聽progenitors\[J\].聽J聽He聽matother,聽1997,6（6）:543549.

［6］Slunt聽JB,聽Taketomi聽EA,聽PlattsMills聽TA,聽et聽al.聽Human聽Tcell聽responses聽to聽Trichopyton聽tonsurans:聽Inhibition聽using聽the聽serum聽free聽medium聽Aim聽V\[J\].聽Clin聽Exp聽Allergy,聽1997,27（10）:11841192.

［7］Lopez聽R聽D,聽Waller聽E聽K,聽Lu聽P聽H,et聽al.Cd58/LFA3聽and聽IL12聽providede聽by聽activated聽monocytes聽are聽critical聽in聽the聽in聽vitro聽expansion聽of聽CD56+聽T聽cells\[J\].聽cancer聽Immunol聽Immunot,2001,49(12):629640.

［8］Hoyle聽C,聽Bangs聽C聽D,聽Chang聽P,聽et聽al.聽Expansion聽of聽Philadelphia聽chromosomeNegative聽CD3+CD56+聽cytotoxic聽cells聽from聽chronic聽myeloid聽leukemia聽patients聽:in聽virto聽and聽in聽vivo聽efficacy聽in聽severe聽combined聽immunodeficiency聽disease聽mice聽\[J\].Blood,1998,92(9):33183327.

聽

上一篇：一种改进的三糖铁尿素培养基

下一篇：微生物在不同培养基上生长情况的研究