聽
一、实验目的：掌握发酵罐的操作技能，学习微生物在发酵罐上发酵的过程和实验方法。
二、仪器
分光光度计、电热恒温水浴锅、生物发酵智能控制系统。
三、试剂
1、DNS试剂：取6.3g3,5-二硝基水杨酸（DNS）和262mL2mol/LNaOH溶液加到酒石酸钾钠的热溶液中（192g酒石酸钾钠溶于500 mL水中），再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后加水定容至1000mL，保存于棕色瓶中放置7天后使用。
2、10 g/L酪素溶液
3、种子培养基
4、产酶培养基
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四、实验方法
1、学习发酵罐的使用方法。
2、发酵罐中加入培养基，灭菌。
3、接种、培养。
4、测定酶活:
a. 先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热5 min；
b. 按下列程序操作：
试管A（空白）聽聽 （第二试管）聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 试管B（酶试样，作三个平行样）（第三试管）
聽聽聽聽 ↓聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽↓
加酶液2.00 mL聽聽聽聽聽聽 （移液管2ml）聽聽 聽聽聽聽聽聽聽聽聽 加酶液2.00 mL
聽聽聽聽 ↓（40±0.2℃），2 min聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 ↓（40±0.2℃），2 min
加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）（移液管5ml）聽聽聽聽聽聽聽聽 加酪素2.00 mL（摇匀）
聽聽聽 ↓（40±0.2℃），10 min聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 ↓（40±0.2℃），10 min聽聽聽聽聽聽
加酪素2.00 mL（摇匀）（移液管2ml）聽聽聽聽聽聽聽聽 加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）
↓聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽↓
取出静止10 min，过滤 （第四试管，小漏斗）聽 取出静止10 min，过滤
↓聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 ↓
在275 nm波长下，用 10 mm聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 在275 nm波长下，用 10 mm
比色皿测其吸光度聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 比色皿测其吸光度
聽
（5）计算（=135）
X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E
式中聽 X——样品的酶活力（u/g）聽聽聽聽聽 A——试样溶液的平均吸光度
K——吸光常数（K=135）聽聽聽聽聽聽 8——反应试剂的总体积（mL）
2——吸取酶液2.00 mL，以1 mL计聽聽聽 1/10——反应时间10 min，以1 min计
n——稀释倍数聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 E——紫外法与福林法的换算系数（取0.50）
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五、实验进程安排及结果分析
聽聽 （1）第1次实验：在实验老师准备的已灭菌培养基和罐体的前提下，观察罐上接种。同时熟悉罐的结构及每一部件用途。
聽聽 （2）第2次实验：在下摇瓶测定发酵液中蛋白酶活力的同时，每位同学在发酵罐上取样，测定发酵液中蛋白酶活力。
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