聽
1聽聽主题内容与适用范围聽
本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法。聽
本标准适用于食品和食物中毒样品中致泻大肠埃希氏菌的检验。聽
2聽聽引用标准聽
聽聽聽聽GB聽4789.28聽聽食品卫生微生物学检验聽聽染色法、培养基和试剂聽
3聽聽设备和材料聽
3．1聽聽平天：称取检样用。聽
3．2聽聽均质器或乳钵。聽
3．3聽聽温箱：36±1℃，42℃。聽
3．4聽聽水浴：100℃，65～68℃，50℃。聽
3．5聽聽显微镜。聽
3．6聽聽离心机。聽
3．7聽聽酶标仪。聽
3．8聽聽细菌浓度比浊管：Mac聽Farland3聽号。聽
3．9聽聽灭菌广口瓶：500聽mL。聽
3．10聽聽灭菌三角烧瓶：500聽mL，250聽mL。聽
3．11聽聽灭菌平皿：90聽mm×15聽mm。聽
3．12聽聽灭菌试管：10聽mm×75聽mm。聽
3．13聽聽灭菌吸管：1聽mL，5聽mL。聽
3．14聽聽橡皮乳头。聽
3．15聽聽载玻片。聽
3．16聽聽酒精灯。聽
3．17聽聽灭菌金属匙或玻璃棒。聽
3．18聽聽接种棒，镍铬丝。聽
3．19聽聽试管架，试管篓。聽
3．20聽聽冰箱。聽
3．21聽聽注射器聽0.25聽mL，连接内径为聽1聽mm聽塑料小管一段。聽
3．22聽聽灭菌的刀子、剪子、镊子。聽
3．23聽聽小白鼠：1～4聽目龄。聽
3．24聽聽硝酸纤维素滤膜150聽聽mm×50聽聽mmΦ0.45聽聽um。临用时切成两张，每张75聽聽mm
×50聽mm，用铅笔划格，每格聽6聽mm×6聽mm，每行聽10聽格，分聽6聽行。灭菌备用。聽
4聽聽培养基和试剂聽
4．1聽聽乳糖胆盐发酵管：按聽GB聽4789.28聽中聽4.9聽规定。聽
4．2聽聽营养肉汤：按聽GB聽4789.28聽中聽4.8聽规定。聽
4．3聽聽肠道菌增菌肉汤：按聽GB聽4789.28聽中聽4.18聽规定。聽
4．4聽聽麦康凯琼脂：按聽GB聽4789.28聽中聽4.24聽规定。聽
4．5聽聽伊红美蓝琼脂（EMB）：按聽GB聽4789.28聽中聽4.25聽规定。聽
4．6聽聽三糖铁琼脂（TSI）：按聽GB聽4789.28聽中聽4.26,4.27聽规定。聽
4．7聽聽克氏双糖铁琼脂（KI）：按聽GB聽4789.28聽中聽4.28,4.29聽规定。聽
4．8聽聽糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇）聽：按GB聽4789.28中3.2规定。聽聽
4．9聽聽赖氨酸脱羧酶试验培养基：按聽GB聽4789.28聽中聽3.12聽规定。聽
4．10聽聽尿素琼脂（pH7.2）；按聽GB聽4789.28聽中聽3.16聽规定。聽
4．11聽聽氰化钾（KCN）培养基；按聽GB聽4789.28聽中聽3.16聽规定。聽
4．12聽聽蛋白胨水、靛基质试剂：按聽GB聽4789.28聽中聽3,13聽规定。聽
4．13聽聽半固体琼脂：按聽GB聽4789.28聽中聽4.30聽规定。聽
4．14聽聽Honda聽氏产毒肉汤：按聽GB聽4789.28聽中聽4.34聽规定。聽
4．15聽聽Elek聽氏培养基：按聽GB聽4789.28聽中聽4,35聽规定。聽
4．16聽聽氧化酶试剂：按聽GB聽4789.28聽中聽3.18聽规定。聽
4．17聽聽革兰氏染色液：按聽GB聽4789.28聽中聽2.2聽规定。聽
4．18聽聽致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒
素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。聽
4．19聽聽产肠毒素大肠埃希氏菌聽LT聽和聽ST聽酶标诊断试剂盒。聽
4．20聽聽产肠毒素聽LT聽和聽ST聽大肠埃希菌标准菌株。聽
4．21聽聽抗聽LT聽抗毒素。聽
4．22聽聽多粘菌素聽B聽纸片：300IU，φ16聽mm。聽
4．23聽聽0.1%硫柳汞溶液。聽
4．24聽聽2%伊文思蓝溶液。聽
5聽聽检验程序聽
聽聽聽聽致泻大肠埃希菌检验程序如下：聽
聽6聽聽操作步骤聽
6．1聽聽增菌聽
聽聽聽聽样品采集后应尽快检验。聽除了易腐食品在检验之前应预冷藏外，聽一般不冷藏。
以无菌手续称取检验25聽g，加在225聽mL营养肉汤中，以均质器打碎1聽min或用
乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其
余的移入500聽mL广口瓶内，于36±1℃培养6聽h。挑取1聽环，接种于聽1管30聽mL
肠道菌增菌肉汤内，于聽42℃培养聽18聽h。聽
6．2聽聽分离聽
聽聽聽聽将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美
蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平
板，于36±1℃培养18～24聽h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也
要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。聽
6．3聽聽生化试验聽
6．3．1聽聽自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双
糖铁琼脂（KI）。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2聽尿素琼
脂、KCN聽肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在聽36℃培养过液。聽
6．3．2聽聽TSI聽斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性和尿素阴性的培养物为大
肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均
非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。聽
6．4聽聽血清学试验聽
6．4．1聽聽假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希菌的琼脂培养物，用致病
性大肠埃希氏菌、聽侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O聽血清和出
血性大肠埃希氏菌聽O157聽血清做玻片凝集试验。当与某一种多价聽O聽血清凝集时，
再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。聽致泻大肠埃希氏菌所包括的聽O抗原
群见表聽1。如与某一单价聽O聽血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。聽
表聽1聽聽聽致泻大肠埃希氏菌所包括的聽O聽抗原群聽
大肠埃希氏菌的种类聽聽所包括的聽O聽抗原群聽
EPEC聽
O26聽聽O55聽聽O86聽聽O111ab聽聽O114聽聽O119聽聽O125ac聽聽O127聽
O128ab聽聽O142聽聽O158聽
EHEC聽聽O157聽
EIEC聽
O28ac聽聽O29聽聽O112ac聽聽O115聽聽O124聽聽O135聽聽O136聽聽O143聽
O144聽聽O152聽聽O164聽聽O167聽
ETEC聽
O6聽聽O6聽聽O11聽聽O15聽聽O20聽聽O25聽聽O27聽聽O63聽聽O78聽聽O85聽
O114聽聽O115聽聽O26聽聽O128ac聽聽O148聽聽O149聽聽O159聽聽O166聽
O167聽
6．4．2聽聽证实试验：制备聽O聽抗原悬液，稀释至与聽Mac聽Farland3聽号比浊管相当的
浓度。原效价为聽1：160～1：320聽的聽O聽血清，用聽0.5%盐水稀释至聽1：40。稀释血
清与抗原悬液在聽10聽mm×75聽mm聽试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于
50℃水浴箱内，经聽16聽h聽后观察结果。如出现凝集，可证实为该聽O聽抗原。聽
6．5聽聽肠毒素试验聽
6．5．1聽聽酶联免疫吸附试验检测聽LT聽和聽ST。聽
6．聽5．1．聽1聽聽产毒培养：聽将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于聽0.6聽mLCAYE
培养基内，37℃振荡培养过夜。加入聽20000IU/mL聽的多粘菌素聽B0.05聽mL，于聽37
℃1聽h，离心聽4000聽r/min15聽min，分离上清液，加入聽0.1%硫柳汞聽0.05聽mL，于聽4℃保存待用。聽
6．5．1．2聽聽LT检测方法（双抗体夹心法）聽：聽（1）包被：先在产肠毒素大肠埃希
氏菌聽LT和ST聽酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液聽0.5聽mL，混
匀后全部吸出于聽3.6聽mL聽包被液中混匀，以每孔聽100聽uL聽量加入到聽40聽孔聚苯乙烯
硬反应板中，第一孔留空作对照，于4℃冰箱湿盒中过夜。聽（2）洗板：将板中溶
液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔
中残留液体。聽（3）封闭：每孔加100聽uL封闭液，于37℃水浴中1聽h。聽（4）洗板：
用洗涤液Ⅱ洗3聽次，操作同上。聽（5）加样本：每也分别加各种试验菌株产毒培养
液100聽uL，37℃水浴中1聽h。（6）洗板：用洗涤Ⅱ洗3次，操作同上。聽（7）加酶
标抗体：先在酶标聽LT聽抗体管中加聽0.5聽mL聽稀释液，混匀后全部吸出于聽3.6聽mL聽稀
释液中混匀，每孔加100聽uL，37℃水浴中1聽h。聽（8）洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，
操作同上。聽（9）酶底物反应：每孔（包括第一孔）各加基质液聽100聽uL，室温下
避光作用5～10聽min，加入终止液50聽uL。聽（10）结果判定：以酶标仪在波长492聽
nm聽下测定光度聽OD聽值，待测标本聽OD聽值大于阴性对照聽3聽倍以上为阳性，目测颜色
为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。聽
6．5．1．3聽聽ST聽检测方法（抗原竞争法）聽：聽（1）包被：先在包被用聽ST聽抗原管中
加0.5聽mL包被液，混匀后全部吸出于聽1.6聽mL包被液中混匀，以每孔50聽uL加入
于聽40聽孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻高敲板，使深布满孔底。第一孔留空
作对照，聽置4℃冰箱湿盒中过夜。聽（2）聽洗板：聽用洗涤液I聽洗聽3聽次，聽操作同一。聽（3）
封闭：每孔加聽100聽uL聽封闭液，37℃水浴聽1聽h。聽（4）洗板：用洗涤Ⅱ洗聽3聽次，操
作同上。聽（5）聽加样本及ST聽单克降抗体：聽每孔分别加各试验菌株产毒培养液50聽uL，
稀释的聽ST聽单克隆抗体聽50聽uL（先在聽ST聽单克隆抗体管中加聽0.5聽mL聽稀释液，混匀
后全部吸出于1.6聽mL稀释液中，混匀备用）聽，37℃水浴1聽h。96）洗板：用洗涤
液Ⅱ洗3次，操作同上。聽（7）加酶标记兔抗鼠Ig复合物：称在酶标记兔抗鼠Ig
复合物管中加0.5聽mL稀释液，混匀后全部吸出于聽3.6聽mL稀释液中混匀，每孔加
100聽uL，37℃水浴1聽h。聽（8）洗板：用洗涤液Ⅱ洗聽3次，操作同上。（9）酶底物
反应：每孔（包括第一孔）各加基质液聽100聽uL，室温下避光5～10聽min，再加入
终止液50聽uL。聽（10）结果判定：以酶标仪在波长聽492聽nm聽下测定吸光度（OD）值：聽聽
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽×
鈭扅br>值聽阴性对照
值聽待测样本聽值聽阴性对照
OD
OD聽OD聽≥50%为阳性聽
聽聽聽聽目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。聽
6．5．2聽聽双向琼脂扩散试验检测聽LT：将被检菌株按五点环形接种于聽Elek聽氏培
养基上。以同样操作，共做两份，于聽36℃培养聽48聽h。在每株菌的菌苔上放多粘
菌素聽B聽纸片，于聽36℃经聽5～6聽h，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5聽mm
处的中央，按一个直径聽4聽mm聽的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴
加聽LT聽抗毒素聽30聽uL，用已知产聽LT聽和不产毒菌株作对照，于聽36℃经聽15～20聽h聽观
察结果。聽在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，聽无沉淀带有者为阴性。聽聽
6．5．3聽聽乳鼠罐胃试验检测聽ST聽
聽聽聽聽将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于聽36℃培养聽24聽h，以聽3000聽r/min
离心聽30聽min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃30聽min，每1聽mL滤液内加入
2%伊文思蓝溶液0.02聽mL。聽将此滤液用塑料小管注入1～4目龄的乳鼠胃内0.1聽mL，
同时接种3～4聽只，聽禁食3～4聽h后用三氯甲烷麻醉，聽取出全部肠管，聽称量肠管聽（包
括积液）重量及剩余体得。肠管重量与剩余体重之比大于聽0.09聽为阳性，0.07～
0.09聽为可疑。聽
6．6聽聽结果报告聽
聽聽聽聽综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。聽
聽聽聽附加说明：聽
本标准由卫生部卫生监督司提出。聽
本标准由江西省卫生防疫站负责起草。聽
本标准主要起草人何晓青。聽
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。聽聽聽聽
聽聽聽

聽

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