聽聽聽
聽聽聽中华人民共和国进出口商品检验行业标准聽SN聽0331—94
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽出口畜产品中炭疽杆菌检验方法
Methods聽for聽the聽inspection聽of聽bacillus聽anthrax
in聽animal聽by-products聽for聽export聽代替聽ZB聽X09聽010—86
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1聽主题内容与适用范围
本标准规定了出口畜产品中炭疽杆菌的检验。
本标准适用于出口鬃、毛、绒、野生动物毛皮、生骨粒及其他畜产品中炭疽杆菌
的检验。
2聽设备和材料
2.1聽离心机：带容量在聽500mL以上的离心管。
2.2聽恒温培养箱：36±1℃。
2.3聽恒温水浴：30～65℃。
2.4聽生物学显微镜。
2.5聽三角烧瓶：容量聽250mL、500mL和聽1聽000mL,带胶塞。
2.6聽平皿：直径聽90mm或聽100mm。
2.7聽试管：10mm×120mm聽和聽20mm×140mm聽。
2.8聽吸管：1聽ml和10聽ml,带聽0.01聽mL聽和0.1聽mL刻度。
2.9聽L形玻璃棒。
2.10聽注射器：1聽mL聽带聽5号针头。
2.11聽棉拭子：长180聽mm聽的竹签或铁丝,一端裹聽20～30聽mm长的棉球,用水浸湿,另一端
裹在试管的棉塞内,插入试管高压灭菌。
2.12聽棉布袋：70聽mm×130聽mm,带缩口绳。
2.13聽养鼠罐。聽
3聽培养基和试剂
3.1聽溶菌酶多粘菌素琼脂：见A1。
3.2聽戊烷脒多粘菌素琼脂：见A2。
3.3聽营养肉汤：见A3。
3.4聽营养琼酯：见A4。
3.5聽洗样液：见A5。
3.6聽生理盐水：见A6。
3.7聽缓冲生理盐水：见A7。
3.8聽固定液：见A8。
3.9聽炭疽杆菌噬菌体：见A9。
3.10聽革兰氏染色液：见A10。
3.11聽大豆凝集素稀释液：见A11。
4聽抽样聽
4.1聽鬃、毛、绒、生骨粒
4.1.1聽抽样数量
按生产日期或原料来源划分批次。每批按聽30％开包(箱)抽样或在扎包(装箱)时由
每包(箱)各取一份样品。
4.1.2聽抽样方法
用火焰灭菌的镊子或戴经消毒的乳胶手套从每包(箱)的不同部位共抽样聽3～5g,装入
灭菌棉布袋内,将袋口扎紧,作上批次标记。
4.1.3聽送样
将样品装入塑料袋或铁桶内,密封后送样。聽
4.2聽动物毛皮
4.2.1聽抽样比例
逐张取样。
4.2.2聽抽样方法
用灭菌棉拭子涂擦样皮的真皮面。将棉拭子插入试管,塞紧棉塞。
4.2.3聽送样
将试管逐支用纸包裹,装入铁桶内,再用棉花或软纸填充空隙,密封后送样。
5聽样品处理
5.1聽鬃、毛、绒、生骨粒
5.1.1聽根据样品多少将适当数量的同批样品(最多不超过聽10份)合编为一个检验样品单
位,作好记录。
5.1.2聽从合编为一个检验样品单位的每个样品袋中各取聽1～2g样品,一起放入一个适当
大小的灭菌三角烧瓶中。
5.1.3聽加样品量聽30～40倍(W/V)的预冷洗样液于三角烧瓶,用灭菌胶塞将瓶口塞严。
5.1.4聽将三角烧瓶放入冰水浴或聽0～4℃冰箱内,间或摇动约聽1h。
5.1.5聽将瓶中洗样液倒入聽500mL灭菌离心管内,盖住管口,以3000r/min离心20min。
5.1.6聽弃去上清液(注意防止污染),加少许灭菌水,使沉淀均匀悬浮。
5.1.7聽将离心管静置聽5～10min,待杂质下沉后,将上悬液移入另一支灭菌试管内,于
65℃恒温水浴加热聽30聽min。
5.1.8聽加洗样液后的样品于热处理前如不能及时检验,应贮于0～4℃冰箱内,以防芽
胞发芽。
5.2聽动物毛皮
如不立即检验,将棉拭子放于0～4℃冰箱内。
6聽检验方法
6.1聽分离培养
6.1.1聽鬃、毛、绒、生骨粒
6.1.1.1聽根据每管所包括样品份数之多少,各接种聽1～3个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷
脒多粘菌素平板。接种时,用灭菌吸管吸取样液,滴加于平板表面,各0.1～0.3mL。如有
剩余样品,可增接数个平板,直至将样品接种完。
6.1.1.2聽用灭菌聽L形玻璃棒将滴加的样液涂布均匀。如样液较多,可将平板置于36±1℃
温箱,微开皿盖,使样液迅速干燥。
6.1.1.3聽翻转平皿,置于36±1℃恒温箱,培养聽24～48h。
6.1.2聽动物毛皮
6.1.2.1聽将棉拭子由试管内取出,各涂抹一个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌平板。
6.1.2.2聽翻转平皿,置于36±聽1℃恒温箱,培养聽24～48聽h。
6.2聽菌落及菌形观察
6.2.1聽将培养的平板取出,用肉眼,必要时借助放大镜观察有无典型炭疽杆菌菌落。炭疽
杆菌菌落扁平、暗灰色、不透明、无光泽、表面粗糙、边缘不整齐。用放大镜观察,边缘
呈卷发状,用接种针探触,有粘滞感,挑之,可拉起丝。
6.2.2聽从典型或可疑菌落取培养物制备涂膜,经革兰氏染色,镜检。炭疽杆菌被染成蓝
紫色,由多个菌纵连成长链。少数单个菌呈大杆状,两端平齐。有的菌体中央可见卵圆形
不着色的芽胞。芽胞不使菌体膨大。
6.3聽肉汤培养特性观察
取菌落和菌形均似炭疽杆菌的培养物,接种肉汤管,于聽36±1℃恒温箱培养聽5～12h,
观察细菌生长情况。炭疽杆菌在肉汤中生长初期的特征是：肉汤上部澄清,无菌膜,下部
有絮状沉淀,沉淀不易摇散。
6.4聽确定试验
6.4.1聽大豆凝集素吸收试验
6.4.1.1聽方法
a.聽加大豆凝集素稀释液(A11)一滴于比色板或载玻片上。
b.聽用接种环取一满环可疑菌落,研混于大豆凝集素稀释液内成浓厚菌液,持续搅拌
2～3min。
c.聽加一滴聽5％兔血球悬液,搅匀,前后倾动玻片聽3～5min,观察血球是否凝集。
6.4.1.2聽判定
＋＋＋＋：血球凝集成块状,均匀散布,液体无色。
＋＋＋：血球凝集成大颗粒,均匀散布,液体无色。
＋＋：血球凝集成颗粒,均匀散布,液体无色。
＋：血球凝集成细小颗粒,均匀散布,液体无色。
±：血球凝集成细微颗粒,均匀散布,液体呈不显著黄红色。
－：血球不凝集,摇动后汇集于中央,呈淡黄红色,液体呈不显著黄红色。
注：“＋＋＋”～“＋”为阳性。“±”为可疑。“－”为阴性。
6.4.2聽噬菌体裂解试验
6.4.2.1聽方法
a.聽用营养琼脂平板的皿底外面画三个直径约聽30mm聽,相隔约聽20mm为圆圈。
b.聽用接种环取可疑炭疽杆菌的新鲜肉汤培养物涂满与两个圆圈相对应的琼脂表面。
另取已知炭疽杆菌的新鲜肉汤培养物,涂满与第三个圆圈相对应的琼脂表面,作上区分的
标记。
c.聽待菌液被吸干后,在接种被检菌的圆圈内,一个加一滴无菌肉汤,另一个加一
滴炭疽杆菌噬菌体。在接种已知炭疽杆菌的圆圈内,加一滴炭疽杆菌噬菌体。
d.聽将平皿放入36±1℃聽恒温箱(隔架面要平,以防噬菌体液流散),微开皿盖,使
液体迅速干燥。然后翻转平皿,培养12～18h。
6.4.2.2聽判定
a.聽加噬菌体的两个圆圈内都出现蚀斑,加肉汤的圆圈内无蚀斑,为阳性反应。
b.聽加已知炭疽杆菌的圆圈内出现蚀斑,加被检菌的两个圆圈内无蚀斑,为阴性反应。
c.聽三个圆圈内都无蚀斑,表明噬菌体已失效,应另换有效噬菌体进行试验。
6.4.3聽串珠试验
6.4.3.1聽方法
a.聽取适量聽4～12h可疑炭疽杆菌肉汤培养物,接种于聽1.8mL肉汤管内(制备湿片在低
倍显微镜下检查,每个视野应含菌链聽5～10条)。
b.聽加聽5IU/mL青霉素聽0.2mL,使青霉素最终浓度为聽0.5IU/mL聽。
C.聽于聽37℃水浴培养聽1～2h聽,取出,加入聽20％聽福尔马林聽0.25聽mL,固定聽10聽min。
d.聽制备湿片,在显微镜下检查。
6.4.3.聽判定
＋＋＋＋：菌体大而圆,均匀,排列整齐；
＋＋＋：菌体圆,均匀,排列整齐；
＋＋：菌体椭圆,排列整齐；
＋：菌体均匀肿大,变粗；
±：菌体大小不一,不圆,排列不整齐；
－：菌体形态无变化。
注：“＋＋＋＋”～“＋”为阳性。“±”为可疑。“－”为阴性。
6.4.4聽动物试验
6.4.4.1聽取可疑炭疽杆菌的肉汤培养物,用生理盐水稀释为聽10聽000个菌/mL(微混浊),
接种聽2～3只小白鼠。一只于皮下注射聽0.1mL；其余每只于腹腔注射聽0.2mL。
6.4.4.2聽如小白鼠死亡(通常于1～3d内),立即进行剖检,观察有无炭疽病理变化(如皮
下胶样水肿,脾脏肿大,血凝不良),制备数张血液和腹水涂片,供做菌形检查,同时取
病变材料或体液接种数管肉汤,以备核查。
6.4.5聽染色镜检
6.4.5.1聽染色液的配制
A液：
美蓝聽0.3g
乙醇(95％)聽30.0mL
B液：
0.01％氢氧化钾溶液聽100mL
将聽A、B两液混合而成。
6.4.5.2聽染色方法
a.聽将被检材料的涂片浸入固定液内聽15～20聽min；
b.聽滴加染色液浸没涂膜,染色聽1～2聽min；
c.聽用水冲去染色液,自然干燥或用吸墨纸吸干水分；
d.聽镜检。
6.4.5.3聽判定
炭疽菌菌体呈蓝色,粗大杆状,两端平齐,相连成短链或成对,菌体周围以淡蓝紫色
荚膜。
7聽结果的判定和报告
7.1聽结果的判定
在菌落形态、细菌形态和肉汤生长特性三项中有一项不符合炭疽杆菌特征时,判为
非炭疽杆菌。在其余五项试验(确定试验)中有两项或更多项不符合炭疽杆菌特征时,判
为非炭疽杆菌；全部符合或仅有一项不符合炭疽杆菌特征时,判为有炭疽杆菌。
7.2聽结果的报告
7.2.1聽凡结果判为非炭疽杆菌的检验样品,报告该样品所代表的同批产品“经检验未发
现炭疽杆菌”。
7.2.2聽凡结果判为有炭疽杆菌的检验样品,报告该样品所代表的同批产品“经检验发现
炭疽杆菌”。
附聽录聽A
培养基和试剂
(补充件)
A1聽溶菌酶多粘菌素琼脂(Knisely)
营养琼脂(见A4)聽1聽000mL
多粘菌素聽3聽000IU
溶菌酶聽4聽mg/mL聽溶液聽10聽mL
乙酸亚铊聽4聽mg/mL聽溶液聽10聽mL
EDTA聽20聽mg/mL聽溶液聽10聽mL
除营养琼脂外,将其他成分用灭菌蒸馏水配成适当贮备液,按以上量加于冷至聽50～
55℃聽的灭菌营养琼脂内,充分摇匀,倾注平板。
A2聽戊烷脒多粘菌素琼脂
A2.1聽基础培养基
牛肉膏聽3.0g
蛋白胨聽20.0g聽
氯化钠聽5.0g
琼脂聽20.0g
蒸馏水聽1聽000.0mL
将各成分加于蒸馏水中,煮沸至完全溶解,调整pH至7.4,过滤,分装于三角烧
瓶中,每瓶聽400mL,121℃高压灭菌聽20min。临时用加热融化,放于聽45～50℃恒温水
浴内保温。
A2.2聽戊烷脒稀释液
称取戊烷脒聽0.1g,溶于聽4mL灭菌蒸馏水内。贮存在聽0～4℃聽冰箱,备用。
A2.3聽多粘菌素稀释液
取多粘菌素聽B一瓶,加灭菌蒸馏水使其溶解,再用灭菌蒸馏水将其稀释为3000IU/mL。
贮存于0～4℃冰箱,备用。
A2.4聽脱纤维羊血
以无菌操作采羊血聽50～10聽mL聽,注入含玻璃小珠的灭菌三角烧瓶中,立即转摇数分
钟。贮存于聽0～4℃冰箱,备用。
A2.5聽完全培养基
基础培养基(45～50℃)聽400.0聽mL
戊烷脒稀释液聽0.4聽mL
多粘菌素稀释液聽0.4聽mL
脱纤维羊血聽8.0聽mL
以无菌操作将后三种成分加入基础培养基内,充分摇匀,倾注于灭菌皿内,每皿15mL
左右。
A3聽营养肉汤．
牛肉膏聽3.0g
蛋白胨聽20.0g
氯化钠聽5.0g
蒸馏水聽1000.0mL
将各成分溶于蒸溜水中,调整pH至7.4,分装于试管内,每管1.0mL,121℃高压灭菌15min。聽
A4聽营养琼脂
牛肉膏聽3.0g
蛋白胨聽20.0g
氯化钠聽5.0g
琼脂聽20.0g
蒸馏水聽1聽000.0mL
将各成分加于蒸馏水中,煮沸至完全溶解,补足失去的水分,调整pH至7.2,过滤,
121℃聽高压灭菌聽20聽min聽。待冷至聽50℃左右时,倾注于平皿,制成平板。
A5聽洗样液
吐温-20聽2.5mL
蒸馏水聽1聽000mL
将吐温-20加于蒸馏水中,充分搅匀,分装于三角烧瓶或试剂瓶内,121℃高压灭菌。
贮存于聽0～4℃冰箱,备用。
A6聽生理盐水
氯化钠聽8.5g
蒸馏水聽1000.00mL
待氯化钠完全溶解后,分装于三角烧瓶或试剂瓶内,121℃高压灭菌聽20min。
A7聽缓冲生理盐水
无水磷酸氢二钠聽1.42聽g
氯化钠聽8.50聽g
蒸馏水聽1聽000.00聽mL
将各成分加于蒸馏水中,加热搅拌使完全溶解。如欲长期保存,可加聽0.1g硫柳汞(最
终浓度为聽0.01％)。
A8聽固定液
无水乙醇聽600聽mL
三氯甲烷聽300聽mL
甲醛溶液(36％～38％)聽100聽mL
将三种成分混匀,贮存于磨砂口带盖试剂瓶内。
A9聽炭疽杆菌噬菌体
γ或聽ω型的均可使用。
A10聽革兰氏染色液及染色方法
A10.1聽Hucker聽氏结晶紫液
A液：
结晶紫(或龙胆紫)聽2.0g
聽乙醇(95％)聽20.0mL
B液：
草酸铵聽0.8g
蒸馏水聽80.0聽mL
将聽A、B两液混匀,放置聽24聽h后,用粗滤纸过滤。贮于磨砂口滴瓶内。聽
A10.2聽革兰氏碘液
碘聽1.0聽g
碘化钾聽2.0聽g
蒸馏水聽300.0聽mL聽
将碘和碘化钾放于乳钵内,研成细粉。先后分三次分别加蒸馏水1mL聽、5mL和10聽mL,
继续研磨至完全溶解,倒入褐色瓶中。再加水将残留于乳钵的碘液洗入瓶中,补加蒸馏水
至300mL。
A10.3聽脱色剂
95％乙醇聽适量
贮于磨砂口滴瓶中。
A10.4聽Hucker氏复染液(贮备液)
沙黄聽O聽2.5聽g
乙醇(95％)聽100mL
临用时,取适量贮备液,加蒸馏水稀释成聽1:10稀释液。
A10.5聽染色方法
a.聽于载玻片上制备涂膜,自然干燥；
b.聽将玻片浸入固定液内,固定聽1聽min；
c.聽加结晶紫于涂膜上,染色聽1聽min；
d.聽用水冲去染色液,淋去多余的水；聽
e.聽加革兰氏碘液于涂膜上,媒染聽1聽min；
f.聽用水冲去碘液；
g.聽连续加聽95％乙醇流过涂膜,至无紫色脱掉；
h.聽用水冲洗玻片,淋去多余的水；
i.聽加复染液于涂膜上,染色聽10～30聽s；
j.聽用水冲去染色液；
k.聽用吸墨纸吸干水分或自然干燥；
l.聽镜检。
A11聽大豆凝集素稀释液
按试剂使用说明制备工作稀释液,贮于聽4℃冰箱备用。
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附加说明：
本标准由中华人民共和国进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国内蒙古进出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人甄宏太、周云霞。
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中华人民共和国国家进出口商品检验局聽1994-12-26批准聽1995-05-01实施

聽

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