主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法(D聽N聽A染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

第一法培养法

推荐培养基及其处方

(1)支原体液体培养基

支原体肉汤培养基

猪胃消化液聽聽聽聽聽聽500ml聽聽聽聽氯化钠聽聽聽聽聽2.5g

牛肉浸液（1:聽2)聽聽500ml聽聽聽聽葡萄糖聽聽聽聽聽5.0g

酵母浸粉聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0g聽聽聽聽聽酚红聽聽聽聽聽0.02g

pH值7.6±0.2，于121℃灭菌15分钟。

精氨酸支原体肉汤培养基

猪胃消化液聽聽聽聽聽聽500ml聽聽聽聽葡萄糖聽聽聽聽1.聽0g

牛肉浸液（1:聽2)聽聽500ml聽聽聽聽L-精氨酸聽聽2.聽0g

酵母浸粉聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0g聽聽聽聽聽酚红聽聽聽聽聽0.02g

氣化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.5g

pH值7.1±0.2，于121℃灭菌15分钟。

(2)支原体半流体培养基按（1)项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2聽.5銆?.聽Og。

(3聽)支原体琼脂培养基按（1)项处方配制，培养基中不加酚红，加人琼脂13.聽0銆?5.0g。

除上述推荐培养基外，亦可使用可支持支原体生长的其他培养基，但灵敏度必须符合要求。

培养基灵敏度检査（变色单位试验法）(1)菌种肺炎支原体（ATCC聽15531株）、口腔支原体（ATCC聽23714株），由国家药品检定机构分发。

(2聽)操作聽将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃聽培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至

10-7銆?0-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3銆?0-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3聽支试管，置36℃±1℃培养7銆?4天，观察培养基变色结果。

(3聽)结果判定以接种后培养基管数的2聽/聽3聽以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。

液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC聽15531株）应达到10-8，口腔支原体(聽ATCC聽23714株)应达到10-聽4。

检査法

(1聽)供试品如在分装后2聽4小时以内进行支原体检査者可贮存于2銆?°C;聽超过2聽4小时应置一20°C以下贮存。

(2聽)检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基(或支原体琼脂培养基）。半流体培养基（或琼脂培养基)在使用前应煮沸10銆?聽5分钟，冷却至56°C左右，然后加人灭能小牛血清（培养基:聽血清为8聽：聽2)聽，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。

聽聽聽取每支装量为10ml的支原体液体培养基各4聽支、相应的支原体半流体培养基各2聽支（已冷至36℃±1℃聽)聽，每支培养基接种供试品0聽.5銆?.0ml，置培养2聽1天。于接种后的第7天从4聽支支原体液体培养基中各取2聽支进行次代培养，每支培养基分别转种至相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各2聽支，置36℃±1℃培养2聽1天，每隔3聽天观察1次。

(3聽)结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。

【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。

第二法聽指示细胞培养法（DNA染色法>将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体D聽N聽A着色。

试剂

(1)二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst聽33258)浓缩液

称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank’聽s平衡盐溶液中，在室温用磁力搅拌30銆?0分钟，使完全溶解，-20°C避光保存。

(2)二苯甲酰胺荧光染料工作液聽

无酚红和碳酸氢钠的Hank’聽s溶液100ml中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液1ml，混匀。

(3聽)固定液乙酸：甲醇（1聽:聽3聽)混合溶液。

(4聽)封片液量取O.lmol/L枸橼酸溶液22.聽2ml、0.聽2mol/L磷酸氢二钠溶液27.聽8ml、甘油50.0ml混匀，调p聽H聽至5.聽5。

培养基及指示细胞

(l)D聽M聽E聽M聽完全培养基。

(2)DM聽EM无抗生素培养基。

(3)指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞）聽取培养的Vero细胞经消化后，制成每lm聽l含105的细胞悬液，以每孔0.聽5m聽l接种6聽孔细胞培养板或其他容器，每孔再加无抗生素培养基3ml，于5%聽二氧化碳孵箱36℃±1℃：培养过夜，备用。

供试品处理

（1)细胞培养物将供试品经无抗生素培养液至少传一代，然后取细胞已长满的且3聽天未换液的细胞培养上清液待检。

(2聽)毒种悬液如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。

(3聽)其他供试品检査时所选用的指示细胞，应为该供试品对其生长无影响的细胞。

测定法于制备好的指示细胞培养板中加人供试品（细胞培养上清液）2ml(毒种或其他供试品至少lm聽l聽)聽,置5%聽二氧化碳孵箱36°C士1°C培养3銆?聽天。指示细胞培养物至少传代1聽次，末次传代培养用含盖玻片的6聽孔培养板培养3銆?天后，吸出培养孔中的培养液，加人固定液5ml，放置5聽分钟，吸出固定液，再加5m聽l固定液固定10分钟，吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥，加二苯甲酰胺荧光染料（或其他D聽N聽A染料）工作液5ml，加盖，室温放置3聽0分钟，吸出染液，每孔用水5m聽l洗3聽次，吸出水，盖玻片于空气中干燥，取洁净载玻片加封片液1滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。用无抗生素培养基2m聽l替代供试品，同法操作，作为阴性对照。

用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品，同法操作，作为阳性对照。

结果判定

（1)阴性对照仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。

(2聽)阳性对照荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。如供试品结果为阴性，则供试品判为合格；如供试品结果为阳性或可疑时，应进行重试；如仍阳性时，供试品判为不合格。

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