1聽范围

本标准规定了食品中双歧杆菌（Bifidobacterium聽）的鉴定方法。

本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。

2聽设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

a）聽恒温培养箱：36聽℃±1聽℃；

b）聽气相色谱仪配FID聽检测器；

c）聽冰箱：2聽℃～5聽℃；

d）聽天平：聽感量0.1聽g；

e）聽无菌试管：18聽mm×180聽mm、15聽mm×100聽mm；

f）聽无菌吸管：1聽mL（具0.01聽mL聽刻度）、10聽mL（具0.1聽mL聽刻度）或微量移液器（200聽μL~1000聽μL）及配套吸头；

g）聽无菌锥形瓶：500聽mL、250聽mL。

3聽培养基和试剂

3.1聽双歧杆菌培养基：见附录A聽中的A.1。

3.2聽PYG聽液体培养基：见附录A聽中的A.2。

3.3聽甲醇：分析纯。

3.4聽三氯甲烷：分析纯。

3.5聽硫酸：分析纯（体积比）。

3.6聽冰乙酸：分析纯（体积比）。

3.7聽乳酸：分析纯。

3.8聽乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7聽mL，移入100聽mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1聽mol/L。

3.9聽乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01聽mol/L。

3.10聽乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4聽mL，移入100聽mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1聽mol/L。

3.11聽乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01聽mol/L。

4聽鉴定程序

双歧杆菌鉴定程序见图1。

聽

聽

5聽操作步骤

5.1聽样品制备

5.1.1聽样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

5.1.2聽以无菌操作称取25聽g（mL）样品，置于装有225聽mL聽生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成1:10聽的样品匀

液。

5.2聽稀释及涂布培养步骤

5.2.1聽用1聽mL聽无菌吸管或微量移液器吸取1:10聽样品匀液1.0聽mL，沿管壁缓慢注于装有9聽mL聽生理盐水的

无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1聽支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制

成1:100聽的样品匀液。

5.2.2聽另取1聽mL聽无菌吸管或微量移液器吸头，按5.2.1聽操作顺序，做10聽倍递增样品匀液，每递增稀释一

次，即换用1聽次1聽mL聽灭菌吸管或吸头。

5.2.3聽根据待鉴定菌种的活菌数，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1聽mL聽稀释液，用L聽棒

在双歧杆菌琼脂平板进行表面涂布,聽每个稀释度作两个平皿。置36聽℃±1聽℃聽温箱内培养48聽h±2聽h，培养后

选取单个菌落进行纯培养。

5.3聽纯培养

挑取3聽个或以上的菌落接种于双歧杆菌琼脂平板，厌氧，36聽℃±1聽℃聽培养48聽h。

5.4聽镜检及生化鉴定

5.4.1聽涂片镜检

双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或

球形，可形成各种分支或分叉形态。

5.4.2聽生化鉴定

过氧化氢酶试验为阴性。选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌

菌种主要生化反应见附录B。

5.5聽有机酸代谢产物测定

气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物,聽见附录C。

6聽报告

根据镜检及生化鉴定的结果（5.4）、双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于1（5.5），

报告双歧杆菌属的种名。

附录聽A

培养基

A.1聽双歧杆菌琼脂培养基

A.1.1聽成分

蛋白胨聽15.0聽g

酵母浸膏聽2.0聽g

葡萄糖聽20.0聽g

可溶性淀粉聽0.5聽g

氯化钠聽5.0聽g

西红柿浸出液聽400.0聽mL

吐温80聽1.0聽mL

肝粉聽0.3聽g

琼脂粉聽15.0聽g～20.0聽g

加蒸馏水至聽1聽000.0聽mL

A.1.2聽制法

A.1.2.1聽半胱氨酸盐溶液

称取半胱氨酸0.5聽g，加入1.0聽mL聽盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。

A.1.2.2聽西红柿浸出液

将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在100聽℃水浴中加热，搅拌90聽min，然后用纱布过滤，校正pH7.0，将浸出液分装后，121聽℃高压灭菌15聽min～20聽min。

A.1.2.3聽培养基

将A.1.1聽所有成分加入蒸馏水中，加热溶解,聽然后加入半胱氨酸盐溶液，校正pH聽6.8±0.2。分装后121聽℃高压灭菌15聽min～20聽min。临用时加热熔化琼脂，冷至50聽℃时使用。

A.2聽PYG聽液体培养基

A.2.1聽成分

蛋白胨聽10.0聽g

葡萄糖聽2.5聽g

酵母粉聽5.0聽g

半胱氨酸-HCl聽0.25聽g

盐溶液聽20.0聽mL

维生素K1聽溶液聽0.5聽mL

氯化血红素溶液5mg/mL聽2.5聽mL

加蒸馏水至聽500.0聽mL

A.2.2聽制法

A.2.2.1聽盐溶液

称取无水氯化钙0.2聽g，硫酸镁0.2聽g，磷酸氢二钾1.0聽g，磷酸二氢钾1.0聽g，碳酸氢钠10.0聽g，氯化钠2.0聽g，加蒸馏水至1000聽mL。

A.2.2.2聽氯化血红素溶液（5mg/mL）

称取氯化血红素0.5聽g聽溶于1聽mol/L聽氢氧化钠1.0聽mL聽中，加蒸馏水至1000聽mL，121聽℃高压灭菌15min～20聽min。

A.2.2.3聽维生素K1溶液

称取维生素K11.0聽g，加无水乙醇99聽mL，过滤除菌，冷藏保存。

A.2.2.4聽培养基

除氯化血红素溶液和维生素K1聽溶液外，A.2.1聽其余成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.0，加入中性红溶液。分装后121聽℃高压灭菌15聽min～20聽min。临用时加热熔化琼脂，加入氯化血红素溶液和维生素K1聽溶液，冷至50聽℃使用。

附录聽B

双歧杆菌菌种主要生化反应

双歧杆菌菌种主要生化反应见表B.1。

聽

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