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附录B
五种致泻大肠埃希氏菌PCR鉴定方法
B.1聽试剂和材料
B.1.1聽聽按照表B.1序列在基因合成公司合成引物。
B.1.2聽聽1碌L取菌环。
B.1.3聽聽灭菌去离子水。
B.1.4聽聽0.85%灭菌生理盐水。
B.1.5聽聽10聽mmol/L聽Tris-HCl，1聽mmol/L聽EDTA，聽pH8.0聽TE溶液：量取1聽mol/L聽Tris-HCl缓冲液（pH8.0）5聽mL、0.5聽mol/L聽EDTA溶液（pH8.0）1聽mL于500聽mL烧杯中。加入约400聽mL去离子水均匀混合，将溶液定容至500聽mL，121聽℃高压灭菌15聽min，室温保存。
B.1.6聽聽1.5聽mL聽Eppendorf管，8联排管和8联排盖（平盖/凸盖）。
B.1.7聽聽10×PCR反应缓冲液，含840聽mmoL聽Tris-HCl聽(pH聽8.5)和500聽mmoL聽KCl。
B.1.8聽聽聽25聽mmol/L聽MgCl2。
B.1.9聽聽聽2.5聽mmol/L聽dNTPs：dATP、dTTP、dGTP、dCTP每种浓度为2.5聽mmol/L。
B.1.10聽聽5聽U/碌L聽Taq酶。
B.1.11聽聽阳性对照品：包含12对引物扩增的目标DNA序列或者含有目标基因的标准菌株。
B.1.12聽聽50×TAE电泳缓冲液：称量242聽g聽Tris-HCl聽和聽37.2聽g聽Na2EDTA·2H2O于1聽L烧杯中，加入约800mL去离子水，充分搅拌均匀；加入57.1聽mL的冰乙酸，充分溶解；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1聽L后，室温保存。使用时稀释50倍即为1×TAE电泳缓冲液。
B.1.13聽聽琼脂糖。
B.1.14聽聽溴化乙锭（EB）或其他核酸染料。
B.1.15聽聽6×上样缓冲液。
B.1.16聽聽分子量Marker：至少包含100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp条带。
B.1.17聽聽微量移液器及对应吸头：0.5碌L～2碌L，2碌L聽～20碌L，20碌L聽～200碌L，200碌L～1000碌L。
B.2聽仪器和设备
B.2.1聽聽低温冷冻离心机：控温4℃～8℃，最大转速不小于13000聽rpm。
B.2.2聽聽PCR仪。
B.2.3聽聽天平：感量0.01g。
B.2.4聽聽核酸电泳仪，包括电源、电泳槽、制胶槽（长度>10cm）和梳子。
B.2.5聽聽凝胶成像系统或紫外成像仪。
B.2.6聽聽微量加样器：0.5碌L～2碌L，2碌L～20碌L，20碌L～200碌L，200碌L～1000碌L。
B.3聽检测步骤
B.3.1聽聽DNA模板准备
B.3.1.1聽聽将平板或斜面上生长的菌落悬浮于200聽碌L聽0.85%灭菌生理盐水中，充分打散形成菌悬液，13000聽rpm离心3聽min。
B.3.1.2聽聽弃掉上清液，使用1聽mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100聽°C水浴或者金属浴维持10聽min。
B.3.1.3聽聽冰浴冷却后，13000聽rpm离心3聽min，收集上清液，用灭菌去离子水按1:10稀释上清液，取2聽碌L作为PCR检测的模板。
B.3.1.4聽聽也可用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行操作；所有处理后的DNA模板在-20°C以下保存备用。
B.3.2聽聽PCR对照
聽聽聽聽每次PCR反应使用EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC、EAEC标准菌株或阳性对照品作为阳性对照。同时，使用大肠埃希氏菌ATCC聽25922作为阴性对照，使用灭菌去离子水作为空白对照，控制PCR体系污染。
B.3.3聽聽PCR反应体系配制及扩增
每个样品初筛需配置12个PCR扩增反应体系，对应检测12个目标基因，具体操作如下：
B.3.3.1聽使用TE溶液（pH8.0）将合成的引物干粉稀释成100聽碌mol/L储存液。
B.3.3.2聽根据表B.1中每种目标基因对应PCR体系内引物的终浓度，使用灭菌去离子水配制12种目标基因扩增所需的10×引物工作液（以uidA基因为例，如表B.2）。
表B.1聽五种致泻大肠埃希氏菌目标基因引物序列及每个PCR体系内的终浓度
|
引物名称 |
引物序列c |
终浓度n（碌mol/L） |
PCR产物长度(bp) |
|
uidA–F |
5′-ATG聽CCA聽GTC聽CAG聽CGT聽TTT聽TGC-3′ |
0.2 |
1487 |
|
uidA–R |
5′-AAA聽GTG聽TGG聽GTC聽AAT聽AAT聽CAG聽GAA聽GTG-3′ |
0.2 |
|
|
escV–F |
5′-ATT聽CTG聽GCT聽CTC聽TTC聽TTC聽TTT聽ATG聽GCT聽G-3′ |
0.4 |
544 |
|
escV–R |
5′-CGT聽CCC聽CTT聽TTA聽CAA聽ACT聽TCA聽TCG聽C-3′ |
0.4 |
|
|
eae-Fa |
5′-ATT聽ACC聽ATC聽CAC聽ACA聽GAC聽GGT-3′ |
0.2 |
397 |
|
eae-Ra |
5′-ACA聽GCG聽TGG聽TTG聽GAT聽CAA聽CCT-3′ |
0.2 |
|
|
bfpB–F |
5′-GAC聽ACC聽TCA聽TTG聽CTG聽AAG聽TCG-3′ |
0.1 |
910 |
|
bfpB–R |
5′-CCA聽GAA聽CAC聽CTC聽CGT聽TAT聽GC-3′ |
0.1 |
|
|
stx1–F |
5′-CGA聽TGT聽TAC聽GGT聽TTG聽TTA聽CTG聽TGA聽CAG聽C-3′ |
0.2 |
244 |
|
stx1–R |
5′-AAT聽GCC聽ACG聽CTT聽CCC聽AGA聽ATT聽G-3′ |
0.2 |
|
|
stx2–F |
5′-GTT聽TTG聽ACC聽ATC聽TTC聽GTC聽TGA聽TTA聽TTG聽AG-3′ |
0.4 |
324 |
|
stx2–R |
5′-AGC聽GTA聽AGG聽CTT聽CTG聽CTG聽TGA聽C-3′ |
0.4 |
|
|
lt–F |
5′-GAA聽CAG聽GAG聽GTT聽TCT聽GCG聽TTA聽GGT聽G-3′ |
0.1 |
655 |
|
lt–R |
5′-CTT聽TCA聽ATG聽GCT聽TTT聽TTT聽TGG聽GAG聽TC-3′ |
0.1 |
|
|
stp–F |
5′-CCT聽CTT聽TTA聽GYC聽AGA聽CAR聽CTG聽AAT聽CAS聽TTG-3′ |
0.4 |
157 |
|
stp–R |
5′-CAG聽GCA聽GGA聽TTA聽CAA聽CAA聽AGT聽TCA聽CAG-3′ |
0.4 |
|
|
sth–F |
5′-TGT聽CTT聽TTT聽CAC聽CTT聽TCG聽CTC-3′ |
0.2 |
171 |
|
sth–R |
5′-CGG聽TAC聽AAG聽CAG聽GAT聽TAC聽AAC聽AC-3′ |
0.2 |
|
|
invE–F |
5′-CGA聽TAG聽ATG聽GCG聽AGA聽AAT聽TAT聽ATC聽CCG-3′ |
0.2 |
766 |
|
invE–R |
5′-CGA聽TCA聽AGA聽ATC聽CCT聽AAC聽AGA聽AGA聽ATC聽AC-3′ |
0.2 |
|
|
聽ipaH-Fb |
5′-TTG聽ACC聽GCC聽TTT聽CCG聽ATA聽CC-3′ |
0.1 |
647 |
|
聽ipaH-Rb |
5′-ATC聽CGC聽ATC聽ACC聽GCT聽CAG聽AC-3′ |
0.1 |
|
|
aggR–F |
5′-ACG聽CAG聽AGT聽TGC聽CTG聽ATA聽AAG-3′ |
0.2 |
400 |
|
aggR–R |
5′-AAT聽ACA聽GAA聽TCG聽TCA聽GCA聽TCA聽GC-3′ |
0.2 |
|
|
pic–F |
5′-AGC聽CGT聽TTC聽CGC聽AGA聽AGC聽C-3′ |
0.2 |
1111 |
|
pic–R |
5′-AAA聽TGT聽CAG聽TGA聽ACC聽GAC聽GAT聽TGG-3′ |
0.2 |
|
|
astA–F |
5′-TGC聽CAT聽CAA聽CAC聽AGT聽ATA聽TCC聽G-3′ |
0.4 |
102 |
|
astA–R |
5′-ACG聽GCT聽TTG聽TAG聽TCC聽TTC聽CAT-3′ |
0.4 |
|
|
16S聽rDNA-F |
5′-GGA聽GGC聽AGC聽AGT聽GGG聽AAT聽A-3′ |
0.25 |
1062 |
|
16S聽rDNA-R |
5′-TGA聽CGG聽GCG聽GTG聽TGT聽ACA聽AG-3′ |
0.25 |
聽聽注：聽a：escV和eae基因选作其中一个；b：invE和ipaH基因选作其中一个；c：表中不同基因的引物序列可采用可靠性验证的其他序列代替。
表B.2聽每种目标基因扩增所需10×引物工作液配制表
|
引物名称 |
体积（碌L） |
|
100聽碌mol/L聽uidA–F |
10×n |
|
100聽碌mol/L聽uidA–R |
10×n |
|
灭菌去离子水 |
100聽-聽2×（10×n） |
|
总体积 |
100 |
注：聽n：每条引物在反应体系内的终浓度（详见表B.1）。
B.3.3.3聽聽将10×引物工作液、10×PCR反应缓冲液、25聽mmol/L聽MgCl2、2.5聽mmol/L聽dNTPs、灭菌去离子水从-20℃冰箱中取出，融化并平衡至室温，使用前混匀；5聽U/碌L聽Taq酶在加样前从-20℃冰箱中取出。
B.3.3.4聽聽每个样品按照表B.3的加液量配制12个25聽碌L反应体系，分别使用12种目标基因对应10×引物工作液。
聽聽聽表B.3聽五种致泻大肠埃希氏菌目标基因扩增体系配制表
|
试剂名称 |
加样体积（碌L） |
|
灭菌去离子水 |
12.1 |
|
10×PCR聽反应缓冲液 |
2.5 |
|
25聽mmol/L聽MgCl2 |
2.5 |
|
2.5聽mmol/L聽dNTPs |
3.0 |
|
10×引物工作液 |
2.5 |
|
5聽U/碌L聽Taq酶 |
0.4 |
|
DNA模板 |
2.0 |
|
总体积 |
25 |
B.3.3.5聽聽按照如下反应条件设置PCR仪：预变性94聽℃聽5聽min；变性94聽℃聽30聽s，复性63聽℃聽30聽s，延伸72聽℃聽1.5聽min，30个循环；最后72聽℃延伸5聽min。
B.3.3.6聽聽将配制完成的PCR反应管放入PCR仪中，核查PCR反应条件正确后，启动反应程序。
B.3.4琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物
B.3.4.1聽聽称量4聽g琼脂糖粉，加入至200聽mL的1×TAE电泳缓冲液中，充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。
B.3.4.2聽聽待琼脂糖溶液冷却至60聽℃左右时，加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5聽碌g/mL，充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶的长度要大于10聽cm，适宜厚度为3聽mm～5聽mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。
B.3.4.3聽聽当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后，轻轻拔出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔在阴极端。
B.3.4.4聽向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，液面高于胶面1聽mm~2聽mm聽。
B.3.4.5聽将5聽碌L聽PCR产物与1聽碌L聽6×上样缓冲液混匀后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔中，小心上样于孔中；阳性对照的PCR反应产物加入到最后一个泳道；第一个泳道中加入2聽碌L分子量Marker聽。
B.3.4.6聽聽接通电泳仪电源，根据公式：电压=电泳槽正负极间的距离（cm）×5聽V/cm计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关，电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。
B.3.4.7聽聽电泳30聽min～45聽min后，切断电源。取出凝胶放入凝胶成像系统或紫外成像仪中观察结果，拍照并记录数据。
B.3.5聽结果判定
B.3.5.1聽聽聽电泳结果中空白对照无条带出现，阴性对照仅有uidA条带扩增，阳性对照中出现所有目标条带，PCR检测结果成立。
B.3.5.2聽聽聽根据电泳图中目标条带大小，判断目标条带的种类，记录每个泳道中目标条带的种类。
B.3.5.3聽聽聽在表B.4中查找不同目标条带种类及组合所对应的致泻大肠埃希氏菌类别。
表B.5聽五种致泻大肠埃希氏菌目标条带与型别对照表
|
致病型别 |
目标条带的种类组合 |
|
|
EAEC |
aggR（+） |
uidAc（+/-）
|
|
EPEC |
bfpB（+/-）,聽escVa（+）,聽stx1（-）,聽stx2（-） |
|
|
STEC/EHEC |
escV聽a（+/-）,聽stx1（+）,聽stx2（-）,聽bfpB（-） escV聽a（+/-）stx1（-）,聽stx2（+）,聽bfpB（-） escV聽a（+/-）,聽stx1（+）,聽stx2（+）,聽bfpB（-） |
|
|
ETEC |
lt,聽stp,聽sth中一条或一条以上阳性 |
|
|
EIEC |
invEb（+） |
|
注：a：在判定EPEC或SETC/EHEC时，escV与eae基因等同效果；b：在判定EIEC时，invE与iapH基因等同效果。c：uidA+：97%以上大肠埃希氏菌为阳性。
聽
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