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第二法聽聽单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法
6.聽聽检验程序
7聽聽操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 以无菌操作称取样品25g（mL），放入盛有225 mL 缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌均质袋内（或均质杯）内，连续均质1 min～2 min或以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min。液体样品，振荡混匀，制成1:10的样品匀液。
7.1.2 用 1 mL聽无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1聽支 1聽mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
7.1.3聽按 7.1.2聽操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1聽支 1 mL 无菌吸管或吸头。
7.2 样品的接种
根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），每个稀释度的样品匀液分别吸取1聽mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色（或ALOA）平板中，用无菌L 棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如琼脂平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
7.3 培养
7.3.1 在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36 ℃±1聽℃培养1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36 ℃±1 ℃培养24h～48h。
7.4 典型菌落计数和确认
7.4.1单核细胞增生李斯特氏菌在ALOA平板上为蓝绿色菌落,周围有不透明晕圈；在其他李斯特氏菌显色平板上的菌落特征以产品说明为准。
7.4.2选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在15 CFU～150聽CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果：
a）只有一个稀释度的平板菌落数在15CFU～150CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；
b）所有稀释度的平板菌落数均小于15聽CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；
c）某一稀释度的平板菌落数大于150聽CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
d）所有稀释度的平板菌落数大于150聽CFU 且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；
e）所有稀释度的平板菌落数均不在15聽CFU～150聽CFU 之间且有典型菌落，其中一部分小于15聽CFU 或大于150CFU 时，应计数最接近15CFU 或150聽CFU的稀释度平板上的典型菌落。
以上按公式（1）计算。
f）2 个连续稀释度的平板菌落数均在15CFU～150聽CFU 之间，按公式（2）计算。
7.4.3 从典型菌落中任选5 个菌落（小于5 个全选），分别按5.3、5.4或5.5进行鉴定和确认试验。聽
8.结果计数
公式（1）：
聽
式中：
T——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；
A——某一稀释度典型菌落的总数；
B——某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数；
C——某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数；
d——稀释因子。
公式（2）：
聽
式中：
T ——样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数；
A1——第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；
A2——第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；
B1——第一稀释度（低稀释倍数）确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数；
B2——第二稀释度（高稀释倍数）确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数；
C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数；
C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数；
1.1——计算系数；
d ——稀释因子（第一稀释度）。
9.结果报告
报告每g（mL）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU/g（mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
聽
聽
第三法聽单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法
10聽检验程序
11．操作步骤
11.1 样品的稀释
按7.1进行。
11.2接种和培养
11.2.1根据对样品污染状况的估计，选取3个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），接种于10 mLLB1肉汤，每一稀释度接种3管，每管接种1 mL（如果接种量需要超过1 mL，则用双料LB1增菌液）于30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。每管各移取0.1聽mL，转种于10 mL LB2增菌液内，于30 ℃±1 ℃培养24±2 h。
11.2.2 用接种环从各管中移取1环，分别接种李斯特氏菌显色（或ALOA）平板，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。
11.3 确证试验
自每块平板上挑取5个典型菌落（5个以下全选），按照5.3、5.4或5.5进行鉴定。
12聽聽结果与报告
根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数，查MPN检索表（见附录B），报告每g（mL）样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数，以MPN/g（mL）表示。
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
A.1 聽含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)
A.1.1 聽成分
聽聽聽聽聽聽胰胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽17.0 g
聽聽聽聽聽聽多价胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽3.0 g
聽聽聽聽聽聽酵母膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽6.0 g
聽聽聽聽聽聽氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g
聽聽聽聽聽聽磷酸氢二钾聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.5 g
聽聽聽聽聽聽葡萄糖聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.5 g
聽聽聽聽聽聽蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1 000 mL
聽聽聽聽聽聽pH 7.2～7.4
A.1.2 聽制法
将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.2 聽含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)
A.2.1聽聽成分
聽聽聽聽聽聽胰胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽17.0 g
聽聽聽聽聽聽多价胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽3.0 g
聽聽聽聽聽聽酵母膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽6.0 g
聽聽聽聽聽聽氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g
聽聽聽聽聽聽磷酸氢二钾聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.5 g 聽聽
聽聽聽聽聽聽葡萄糖聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.5 g
聽聽聽聽聽聽琼脂聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽15.0 g
聽聽聽聽聽聽蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.2.2 聽制法
聽聽聽聽将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.3 聽李氏增菌肉汤(LB1，LB2)
A.3.1 聽成分
聽聽聽聽聽聽胰胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g 聽
聽聽聽聽聽聽多价胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g
聽聽聽聽聽聽酵母膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g
聽聽聽聽聽聽氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽20.0 g
聽聽聽聽聽聽磷酸二氢钾聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1.4 g
聽聽聽聽聽聽磷酸氢二钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽12.0 g
聽聽聽聽聽聽七叶苷聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1.0 g
聽聽聽聽聽聽蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.3.2 聽制法
聽聽聽聽将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.3.2.1 聽李氏Ⅰ液聽(LB1)225 mL中加入：
聽聽聽聽聽聽1 % 萘啶酮酸聽(用0.05 mol/L氢氧化钠溶液配制) 聽聽聽聽聽0.5 mL
聽聽聽聽聽聽1 % 吖啶黄聽(用无菌蒸馏水配制) 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.3 mL
A.3.2.2 聽李氏Ⅱ液聽(LB2)200 mL中加入：
聽聽聽聽聽聽1 % 萘啶酮酸聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.4 mL
聽聽聽聽聽聽1 %吖啶黄聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.5 mL
A.4 聽PALCAM琼脂
A.4.1 聽成分
聽聽聽聽聽聽酵母膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽8.0 g
聽聽聽聽聽聽葡萄糖聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.5 g
聽聽聽聽聽聽七叶甙聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.8 g
聽聽聽聽聽聽柠檬酸铁铵聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.5 g
聽聽聽聽聽聽甘露醇聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10.0 g
聽聽聽聽聽聽酚红聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.1 g
聽聽聽聽聽聽氯化锂聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽15.0 g
酪蛋白胰酶消化物聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10.0 g
心胰酶消化物聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽3.0 g
玉米淀粉聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1.0 g
聽聽聽聽聽聽肉胃酶消化物聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g
氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g
琼脂聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽15.0 g
聽聽聽聽聽聽蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1 000 mL
pH 7.2～7.4
A.4.2 聽制法 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽
聽聽聽聽将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.4.2.1 聽PALCAM选择性添加剂
聽聽聽聽聽聽多粘菌素B 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 mg
聽聽聽聽聽聽盐酸吖啶黄聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.5 mg
聽聽聽聽聽聽头孢他啶聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10.0 mg
聽聽聽聽聽聽无菌蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽500 mL
A.4.2.2 聽制法
聽聽聽聽将PALCAM基础培养基溶化后冷却到50 ℃，加入2 ml PALCAM选择性添加剂，混匀后倾倒在无菌的平皿中，备用。
A.5 聽ALOA（Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA)琼脂
A.5.1聽基础培养基
A.5.1.1聽聽成分
动物组织的酶消化物 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽18 g
酪蛋白胰酶消化物 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽6 g
酵母提取物 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10 g
丙酮酸钠 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2 g
葡萄糖 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2 g
甘油磷酸镁 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1 g
无水硫酸镁 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.5 g
氯化钠 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5 g
氯化锂 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10 g
无水磷酸氢钠 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.5 g
5 -溴- 4 -氯-3吲哚-β-D吡喃葡萄糖苷聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.05 g
琼脂 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽12 g～18 g(a)
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽930 ml （b）
a 按琼脂强度确定
b聽如果用两性霉素B为925ml蒸馏水（见A.5.5.2).
A.5.1.2 聽制法
上述成分进行加热溶解，调pH值7.2 ± 0.2，121°C 高压灭菌15min。
A.5.2聽萘啶酮酸溶液
萘啶酮酸钠盐 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.02 g
0.05mol/l的氢氧化钠 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5 ml
溶解萘啶酮酸钠于5ml氢氧化钠溶液中，通过0.45μm膜过滤，4°C保存备用。
A.5.3聽头孢他啶溶液
头孢他啶 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.02 g
无菌蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5 ml
溶解头孢他啶于5ml无菌蒸馏水中，通过0.45μm膜过滤，4°C保存备用。
A.5.4聽多粘菌素B
多粘菌素B硫酸盐聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽76700 IU
无菌蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5 ml
溶解多粘菌素B于5ml无菌蒸馏水中，通过0.45μm膜过滤，4°C保存备用。
A.5.5 抗生素添加剂
A.5.5.1聽放线菌酮溶液
放线菌酮 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.05 g
乙醇 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.5 ml
无菌蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.5 ml
溶解放线菌酮于2.5ml乙醇溶液中，然后加入2.5ml的无菌蒸馏水混匀。通过0.45μm膜过滤，4°C保存备用。
A.5.5.2聽聽两性霉素B溶液（可以替代放线菌酮溶液）
两性霉素B 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.01 g
1聽mol/l 盐酸（HCl (1 mol/l)） 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.5 ml
二甲基甲酰胺(DMF)） 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽7.5 ml
溶解两性霉素在盐酸/二甲基甲酰胺溶液中，通过0.45μm膜过滤，4°C保存备用。
注意---盐酸/二甲基甲酰胺溶液有毒，小心使用。
A.5.6 聽补充剂
溶解2g聽L-α-磷脂酰肌醇于50聽ml蒸馏水中，搅拌30min制成均匀悬浮液。121°C 高压灭菌15min。冷却至48°C～50°C，4°C保存备用。
A.5.7聽聽完全培养基
A.5.7.聽1成分
基础培养基聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽930 ml(a)
萘啶酮酸钠溶液聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5 ml
头孢他啶溶液 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5 ml
多粘菌素B溶液聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5 ml
放线菌酮溶液 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5 ml
或两性霉素B溶液 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10 ml
补充剂聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽50 ml
a 如果使用两性霉素B溶液就需要925ml
A.5.7.2 制法
将基础培养基完全溶解，冷却到50 ℃，加入上述各种溶液，混匀后倾倒在无菌的平皿中，备用。完全培养基的pH值应为7.2 ± 0.2。
A.6 聽革兰氏染色液
A聽6.1 聽结晶紫染色液
A.6.1.1 聽成分
|
结晶紫 |
1.0 g |
|
95％乙醇 |
20.0 mL |
|
1％草酸铵水溶液 |
80.0 mL |
A聽6.1.2 聽制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
A聽6.2 聽革兰氏碘液
A.6.2.1 聽成分
|
碘 |
1.0 g |
|
碘化钾 |
2.0 g |
|
蒸馏水 |
300 mL |
A.6.2.2 聽制法
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。
A.6.3 聽沙黄复染液
A.6.3.1聽聽成分
|
沙黄 |
0.25 g |
|
95％乙醇 |
10.0 mL |
|
蒸馏水 |
90.0 mL |
A.6.3.2 聽制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
A.6.4 聽染色法
A.6.4.1 聽涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液，作用1min,聽水洗。
A.6.4.2 聽滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。
A.6.4.3 聽滴加95％乙醇脱色，约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。
A.6.4.4 聽滴加复染液，复染1 min，水洗、待干、镜检。
A.7 聽SIM 动力培养基聽
A 7.1聽聽成分
聽聽聽聽聽聽胰胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽20.0 g
聽聽聽聽聽聽多价胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽6.0 g
聽聽聽聽聽聽硫酸铁铵聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.2 g
聽聽聽聽聽聽硫代硫酸钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.2 g
聽聽聽聽聽聽琼脂聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽3.5 g
聽聽聽聽聽聽蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1 000 mL
聽聽聽聽聽聽pH 7.2
A.7.2 聽制法
将上述各成分加热混匀，调节pH，分装小试管，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.7.3聽聽试验方法
聽聽聽聽挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM培养基中，于30 ℃培养24 h～48 h，观察结果。
A.8 聽缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)
A.8.1 聽成分
聽聽聽聽聽多胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽7.0 g
聽聽聽聽聽葡萄糖聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g
磷酸氢二钾聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g
聽聽聽聽聽蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1 000 mL
A.1.1.1聽聽聽聽聽聽pH 7.0成分
A.8.2 聽制法
聽聽聽聽溶化后调节pH，分装试管，每管1 mL，121 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.8.3 聽甲基红（MR）试验
A.8.3.1聽聽甲基红试剂
A.8.3.1.1聽聽成分
|
甲基红 |
10 mg |
|
95 %乙醇 |
30 mL |
|
蒸馏水 |
20 mL |
A.8.3.1.2聽聽制法
10 mg甲基红溶于30 mL 95 %乙醇中，然后加入20 mL蒸馏水。
A.8.3.1.3聽聽试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白冻水中，36 ℃±1 ℃培养2 d～5 d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。聽
A.8.4聽聽V-P试验
A.8.4.1 聽6 % α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法：取α-萘酚6.0 g，加无水乙醇溶解，定容至100 mL。
A.8.4.2 聽40 %氢氧化钾溶液
成分及制法：取氢氧化钾40 g，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。
A.8.4.3聽聽试验方法
取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白冻水中，36 ℃±1 ℃培养2 d～4 d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL和40 %氢氧化钾溶液0.2 mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36 ℃±1 ℃继续培养1聽h再进行观察。
A.9 聽血琼脂
A.9.1 聽成分
蛋白胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1.0 g
牛肉膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.3 g
氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽0.5 g
琼脂聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1.5 g
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽100 mL
聽聽聽聽脱纤维羊血聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5 mL～8聽mL
A聽9.2 聽制法聽
聽聽聽聽除新鲜脱纤维羊血外，加热溶化上述各组分，121 ℃高压灭菌15 min，冷到50 ℃，以无菌操作加入新鲜脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。
A.10 聽糖发酵管
A.10.1 聽成分
聽聽聽聽牛肉膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g
聽聽聽聽蛋白胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10.0 g
聽聽聽聽氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽3.0 g
聽聽聽聽磷酸氢二钠(Na2HPO4×12H2O) 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽2.0 g
聽聽聽聽0.2%溴麝香草酚蓝溶液聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽12.0 mL
聽聽聽聽蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1 000 mL
A.10.2 聽制法
A.10.2.1 聽葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5 %比例加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内，调节pH至7.4，115 ℃高压灭菌15 min，备用。
A.10.2.2 聽其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100 mL，115 ℃高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
A.10.3 聽试验方法
聽聽聽聽取适量纯培养物接种于糖发酵管，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察结果，蓝色为阴性，黄色为阳性。
A.11聽聽过氧化氢酶试验
A.11.1聽聽试剂
聽聽聽聽3%过氧化氢溶液：临用时配制。
A.11.2 聽试验方法
聽聽聽聽用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落, 置于洁净试管内，,滴加3%过氧化氢溶液2 mL，观察结果。
A.11.3 聽结果
聽聽聽聽于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。
A.12.聽缓冲蛋白胨水（BPW）
A.12.1成分
蛋白胨 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10.0g
氯化钠 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5.0 g
磷酸氢二钠（Na2HPO4鈥?2H2O） 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽9.0 g
磷酸二氢钾 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1.5 g
蒸馏水 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1 000 mL
pH 7.2
A.12.2. 制法
加热搅拌至溶解,调节pH，121 ℃高压灭菌15 min。
附录B
（规范性附录）
单核细胞增生李斯特氏菌最可能数（MPN）检索表
B.1 每g(mL)检样中单核细胞增生李斯特氏菌最可能数（MPN）
聽
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