低温保存管中之一般菌种临时存放及活化

A. 低温保存管之临时存放及解冻中之一般菌种临时存放及活化

1. 低温保存管（cryo聽tube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。

2.聽准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryo聽tube 之大小），液面不可高达管塞。

3. 将 cryo聽tube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。

4. 不断轻微摇动 cryo聽tube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。

1.聽用无菌微量吸管，从已溶解之cryo聽tube 吸取 1-2滴之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。

2.将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。

1.聽手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约5公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约10公分，等待约10秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖1/3培养基为止（I区）。聽

2.聽灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自I区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II区）。

3.聽重复2的动作完成III 区与IV 区。

4. 灼烧接种环，将接种环归位。

D. 图示

（1）金属接种环

聽

（2）平板划线法

冷冻干燥管之开管说明

下列步骤请在无菌环境下操作：

聽1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。

聽2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。

聽3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。

聽4、( a ) 适用于细菌 聽用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。( b ) 适用于霉菌、酵母菌 聽用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。

聽5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。

聽6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期 ( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养 (Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。

聽7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。

聽8．未开封之冷冻干燥管，请冷藏于4℃冰箱，切勿冷冻保存。

聽

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